近日，浙江大學(xué)良渚實(shí)驗室王永成團隊、浙江大學(xué)生物信息學(xué)研究所樊龍江團隊、浙江大學(xué)醫學(xué)院附屬第一醫院陳瑜團隊聯(lián)合M20 Genomics公司在Protein & Cell上發(fā)表題為High-throughput single-microbe RNA sequencing reveals adaptivestate heterogeneity and host-phage activity associations in human gutmicrobiome的研究論文。
該研究建立了基于隨機引物的高通量單細胞RNA測序技術(shù)及其數據分析方法，首次實(shí)現了復雜微生物組樣本的高通量單細胞轉錄組測序與分析。
通過(guò)對人類(lèi)腸道菌群?jiǎn)渭毎D錄組測序與分析，揭示了人類(lèi)腸道菌群的異質(zhì)性結合針對性的計算分析方法，實(shí)現了復雜微生物群落中的微生物注釋和細菌-噬菌體轉錄活性分析，為人類(lèi)微生物組研究提供新視角。
具體內容
微生物組樣本的單細胞轉錄組測序因樣本中菌群的復雜性和不同物種RNA的低捕獲效率，相對純培養樣本更為困難。
基于團隊之前開(kāi)發(fā)的smRandom-seq(Xu et al.Nat Commun,2023)，通過(guò)優(yōu)化隨機引物設計和反應體系，本研究開(kāi)發(fā)的smRandom-seq2得以提高逆轉錄效率、細菌捕獲效率，并有效降低交叉污染(圖1)。
同時(shí)，研究開(kāi)發(fā)了配套的生信分析方法和工具，用于分析測序得到的微生物組單細胞轉錄組數據，包括單細菌注釋、細菌轉錄表達和噬菌體轉錄表達三個(gè)分析模塊。
通過(guò)上述生信分析方法，可以實(shí)現對每個(gè)微生物的準確分類(lèi)注釋?zhuān)⒖蛇M(jìn)一步開(kāi)展細菌和宿主-噬菌體關(guān)聯(lián)分析。
本研究利用smRandom-seq2對健康人類(lèi)的糞便樣本進(jìn)行單細胞轉錄組測序分析，共捕獲8,478個(gè)細胞，根據注釋結果共鑒定得到98種腸道微生物，其中15個(gè)屬的豐度高于1%，豐度最高的前5個(gè)屬分別為Prevotella、Phascolarctobacterium、Clostridium、Dorea和Roseburia。
根據腸道微生物的轉錄狀態(tài)進(jìn)行降維聚類(lèi)，結果共劃分出11個(gè)細菌簇，屬于9個(gè)不同的細菌屬，包括Prevotella、Clostridium、Fusicatenibacter、Dorea、CAG-81、Roseburia、Phascolarctobacterium.Faecalibacterium和Lachnospira。
Prevotella屬和Roseburia屬分別納入了2個(gè)細菌簇，研究將這兩個(gè)屬的細菌簇進(jìn)一步注釋到物種水平。
本研究進(jìn)一步分析了2種Prevotella菌之間和3種Roseburia菌之間的差異表達基因(DEG)，發(fā)現同一個(gè)屬的不同菌種間存在適應性反應的功能異質(zhì)性，Phascolarctobacterium是腸道菌群中豐度最高的屬之一，而樣本中所有Phascolarctobacterium的細菌均屬于同一菌種:P,succinatutens。
為探索其是否存在種群內異質(zhì)性，研究對其進(jìn)行深入分析，聚類(lèi)結果顯示存在3個(gè)主要細菌亞群并鑒定了這些亞群之間的DEG。
研究發(fā)現與可移動(dòng)遺傳元件以及耐藥相關(guān)的基因，如ISClte1和mdtB等在亞群1中的表達水平顯著(zhù)提高，基因表達共現分析顯示這些基因的表達之間存在顯著(zhù)的共現關(guān)系，提示P.succinatutens的耐藥性可能來(lái)自該亞群同時(shí)，研究發(fā)現亞群2中琥珀酸途徑的相關(guān)基因，如mutB等存在顯著(zhù)的高表達，提示該亞群通過(guò)琥珀酸進(jìn)行化學(xué)能轉換的能力更高。
以上結果揭示了同一菌種在人類(lèi)腸道中的功能異質(zhì)性，體現了其不同的適應策略。
鑒于smRandom-seq2可以同時(shí)測定細菌及其中的噬菌體轉錄本，本研究建立了相應生信分析工具(MIC-Phage)，在單個(gè)微生物水平上分析人類(lèi)腸道菌群中宿主-噬菌體互作的轉錄關(guān)聯(lián)。
分類(lèi)注釋結果顯示了人類(lèi)腸道菌群中9個(gè)主要屬的噬菌體轉錄譜，噬菌體和細菌轉錄譜的聚類(lèi)結果與9個(gè)主要細菌屬的匹配非常吻合，不同屬間噬菌體相關(guān)基因表達水平的顯著(zhù)差異反映了噬菌體特異性感染的特征和能力。
研究選擇每個(gè)屬中轉錄活性最高的前20個(gè)噬菌體(共180個(gè)噬菌體)進(jìn)一步分析，鑒定得到373種可靠的宿主-噬菌體關(guān)聯(lián)，其中至少有325種為新發(fā)現，體現smRandom-seq2在建立準確的體內宿主-噬菌體轉錄活性關(guān)聯(lián)方面的優(yōu)勢。
本研究開(kāi)發(fā)的高通量單細胞轉錄組測序技術(shù)smRandom-seq2，克服了以往技術(shù)的種種限制，能夠處理復雜的微生物群落樣本，可在單個(gè)細菌的分辨率上高效率、高靈敏地分析各種微生物菌群。
利用這一技術(shù)捕獲復雜微生物群落中細菌的功能異質(zhì)性，本研究揭示了人腸道菌群中細菌屬內、種內的適應性策略異質(zhì)性，發(fā)現了數百個(gè)新的宿主-噬菌體轉錄活性關(guān)聯(lián)，開(kāi)啟了人類(lèi)微生物組研究的新方向！
作者信息：
浙江大學(xué)醫學(xué)院附屬第一醫院沈一飛副研究員、浙江大學(xué)農業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院生物信息學(xué)研究所博士生錢(qián)青宏、浙江大學(xué)良渚實(shí)驗室博士后丁利國、浙一醫院碩士生瞿聞馨、M20 Genomics張天宇和宋孟迪為共同第一作者，王永成研究員和樊龍江教授為共同通訊作者。
原文鏈接:https://doi.org/10.1093/procel/pwae027
本文轉載自公眾號“BioArt” / 澎湃新聞
原標題:《【科技前沿】Protein & Cell|王永成/樊龍江團隊合作開(kāi)發(fā)微生物組單細胞轉錄組測序技術(shù)》
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